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19.5.2012 : 2:48
Das Stammzelllabor des Klinikums der Philipps-Universität Marburg an der Abteilung für Hämatologie, Onkologie und Immunologie

Unserem Klinikum ist vor einigen Wochen die Erlaubnis erteilt worden, periphere Blutstammzellen und einige davon abgeleitete Zellprodukte als Medikamente herzustellen. Stammzellen, wie auch andere Blutprodukte, unterliegen dabei nach neuer Rechtssprechung dem Arzneimittelgesetz. Die Herstellung muß daher nach sehr strengen Kriterien erfolgen und ist gesetzlich reguliert. Während früher die Herstellung peripherer Blutstammzellen und des Knochenmarkes allein hämatologischen Kliniken bzw. angeschlossenen Blutbanken oblag, wird der Vorgang nun dem Arzneimittelgesetz unterstellt und muß beim Regierungspräsidium und beim Paul Ehrlich-Institut validiert und zugelassen werden. Wir sind sehr froh, daß es unserem Klinikum mit nicht unerheblichen Anstrengungen gelungen ist, diese Zulassung zu erlangen. In dem folgenden Beitrag wollen wir den Hintergrund eines solches Stammzelllabores schildern und vor allen Dingen darstellen, wofür denn eigentlich diese Blutstammzellen bzw. das menschliche Knochenmark in der Therapie von Patienten mit Blutkrebs oder Lymphknotenkrebs verwendet wird.

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Menschliche Stammzellen

a) B-Zelle, b) T-Zelle, c) Erythrozyt, d) Thrombozyt, e) Monozyt, f) Granulozyt

Jeden Tag kann man diesen Begriff nun auch in der Laienpresse lesen. Zu unterscheiden ist zwischen totipotenten (d.h. in sämtliche menschliche Organe entwicklungsfähigen) embryonalen Stammzellen und sogenannten adulten Stammzellen. Während bei embryonalen Stammzellen die Entnahme kurz nach der Befruchtung erfolgen muß und immer mit dem Ende des Lebens dieses werdenden Menschens assoziiert ist, sind die sogenannten adulten Stammzellen in vielen menschlichen Organen auch beim erwachsenen Menschen vorhanden. Hier zu nennen sind: Knochenmark, Haut, Muskelgewebe und auch Nervengewebe. Diese adulten Stammzellen können also nach der heutigen Erkenntnis bei erwachsenen Menschen in den eben genannten Geweben, möglicherweise auch in anderen, gewonnen werden. Bisher therapeutisch eingesetzt werden seit ca. 40 Jahren aber nur Zellen aus dem Knochenmark bzw. dem peripheren Blut nach Behandlung mit menschlichen Wachstumsfaktoren. Diese Wachstumsfaktoren haben den Sinn, Stammzellen aus dem Knochenmark in das periphere Blut zu mobilisieren und dem betreuenden Arzt die Möglichkeit zu geben, die Stammzellen aus dem Blut zu sammeln, einzufrieren und nach einer Hochdosistherapie zurückzugeben. Andere Organe werden als Quelle von Stammzellen rein wissenschaftlich untersucht, therapeutische Anwendungen haben sie bisher nicht gefunden.

Häufig sind Blutkrebserkrankungen (Leukämien) Stammzellerkrankungen des menschlichen Knochenmarkes. Daraus ergibt sich, daß im Körper das für alle Lebensfunktionen wichtige Knochenmark nicht mehr korrekt funktioniert und eine alleinige Therapie, die nur aus einer Chemotherapie besteht, nicht zu einer Heilung dieser Blutkrebserkrankung führen kann. Bei einer solchen Situation wird sich der behandelnde Arzt entweder am Beginn der Therapie oder aber im weiteren Verlauf, z.B. nach einem Rezidiv der Erkrankung, zur Durchführung einer Transplantation mit gesunden Stammzellen von einem verwandten oder auch von einem unverwandten Spender entschließen. Diese Transplantationen sind mit wesentlichen Risiken verknüpft und können daher nur an ganz spezialisierten Zentren durchgeführt werden. Das Stammzelllabor hat nun die Aufgabe, die aus dem Blut bzw. Knochenmark gewonnenen Stammzellen so zu behandeln, daß unsere Patienten davon profitieren und möglicherweise von ihrer bösen Erkrankung durch diesen Einsatz geheilt werden.

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Was sind denn eigentlich „Stammzellen“?

Stammzellen, oder genauer blutbildende, hämatopoetische Stammzellen, sind Zellen, die in der Lage sind, durch fortwährende Zellteilung während der gesamten Lebenszeit eines Menschen jeden Tag Blutzellen in sehr großer Menge herzustellen. Alle reifen Zellen des strömenden Blutes stammen dabei von dieser einen, hochspezialisierten Art pluripotenter Zellen, den Stammzellen ab (siehe Abbildung 1). Der Begriff der Stammzelle soll dabei verdeutlichen, daß diese eine Zellart Ausgangspunkt für andere, reifere und somit spezialisiertere Zellen ist. Die normalerweise im Knochenmark, also den inneren Hohlräumen unserer Knochen, angesiedelten Stammzellen können nach heutiger Erkenntnis nicht nur alle Zellen des strömenden Blutes herstellen, sondern auch Ausgangszellen für Muskelzellen, Knochenzellen oder sogar Nerven- und Gehirnzellen sein. Forschungsvorhaben, in denen versucht wird, Stammzellen in verschiedene Differenzierungsrichtungen zu bringen und eine Ausreifung dieser Knochenmarkzellen in andere Zellarten zu erzielen, sind ein wesentlicher Schwerpunkt der Abteilung für Hämatologie, Onkologie und Immunologie in Marburg.

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Wie können Stammzellen gesammelt werden?

Entnahme eines kryokonservierten Stammzellprodukts aus dem Flüssigstickstofftank durch Prof. Dr. Neubauer und Frau Loechelt.

Normalerweise befinden sich Stammzellen fast ausschließlich im Knochenmark und nur in sehr geringen, kaum messbaren Mengen im strömenden Blut. Die Gabe eines hormonähnlichen körpereigenen Wachstumsfaktors für weiße Blutkörperchen (genannt: G-CSF, für: Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) kann jedoch eine Mobilisierung und Ausschwemmung der Stammzellen aus dem Knochenmark in das strömende Blut bewirken. Hierzu wird der Wachstumsfaktor für fünf bis sechs Tage zweimal täglich unter die Haut gespritzt. Üblicherweise steigen die weißen Blutkörperchen (Leukozyten) daraufhin auf sehr hohe, übernormale Werte an. Parallel zu diesem überschießenden Anstieg der Leukozyten werden für einige Tage auch Stammzellen aus dem Knochenmark vermehrt in das strömende Blut ausgeschwemmt, so daß diese dort gemessen und bei ausreichend großer Zahl über eine Art Blutwäsche, ähnlich einem Dialyseverfahren, aus dem Blut angereichert werden können.
Eine Alternative zu dieser Blutwäsche stellt die sogenannte „Knochenmarkentnahme“ dar. Dabei werden die im Knochenmark in hoher Konzentration vorkommenden Stammzellen direkt aus dem Beckenknochen herausgesaugt. Der Vorteil einer Knochenmarkentnahme ist, daß hierzu keine Injektionen mit Wachtstumsfaktoren notwendig sind. Allerdings sind die notwendigen Punktionen des Beckenknochens schmerzhaft, so daß die Knochenmarkentnahme üblicherweise in Vollnarkose erfolgt. Mit einer Vollnarkose ist eine Knochenmarkentnahme dann allerdings problemlos durchzuführen und für den Spender mit einer akzeptablen Belastung verbunden.

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Wozu werden die „hämatopoetischen“ Stammzellen benötigt?

Stammzellen werden in der ganz überwiegenden Zahl bei Patienten oder gesunden Spendern gesammelt, um sogenannte Knochenmarktransplantaötionen, die nach heutigem Verständnis besser „Stammzelltransplantationen“ genannt werden, durchführen zu können. Stammzelltransplantationen werden eingesetzt, um Menschen mit lebensbedrohlichen Krebserkrankungen mit einer sehr intensiven Chemotherapie behandeln zu können. Neuerdings können mit Stammzellen aber auch verstärkt Immuntherapien durchgeführt werden. Wir haben hierüber in einer der letzten Ausgabe von „Klinikum Aktuell“ berichtet.
Durch ihre vielfältigen Entwicklungsmöglichkeiten stehen blutbildende, hämatopoetische Stammzellen als „Alleskönner“ im Mittelpunkt der medizinischen Forschung. Einige der neuesten Forschungsentwicklungen wollen wir Ihnen in diesem Heft von „Klinikum Aktuell“ aufzeigen.

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Was können hämatopoetische Stammzellen?

Zunächst einmal können hämatopoetische Stammzellen alle Blutzellen des menschlichen Körpers bilden. D.h., daß aus einer Stammzelle Milliarden verschiedene Blutzellen, also rote Blutkörperchen, Blutplättchen und alle Arten der weißen Blutkörperchen hervorgehen können. Die weißen Blutkörperchen sind in ganz verschiedenen Aufgabenfeldern der Immunabwehr und Infektbekämpfung einbezogen. Ohne weiße Blutkörperchen hätte sich menschliches Leben nicht entwickeln können, da durch die überall vorhandene Anwesenheit von Keimen, Viren und Pilzen sowie anderen Mikroorganismen die Gefährdung des Organismus unüberwindbar groß wäre. Die roten Blutkörperchen sind für die Atmung der entscheidende Transporteur: Sie schaffen den lebensnotwendigen Sauerstoff von der Lunge in alle menschlichen Organe. Die Blutplättchen (=Thrombozyten) sind Zellen, die eine Kommunikation zwischen der Gefäßwand und dem Gerinnungssystem herstellen; wenn wir uns z.B. verletzen, melden die Thrombozyten, daß hier etwas nicht stimmt und vermitteln eine Aktivierung der Gerinnung. Möglicherweise sind Thrombozyten aber auch für andere wesentliche Körperfunktionen wichtig. Zum Beispiel können bestimmte thrombozytäre Veränderungen Stunden vor Beginn eines Herzinfarktes beobachtet werden. Die hämatopoetische Stammzelle ist nun also dafür da, alle Blutzellen, möglicherweise auch andere Zellen, auszubilden. Nun wäre es zu einfach gedacht, daß diese Stammzelle nur im Knochenmark wachsen kann. Bei Feten ist z.B. bekannt, daß auch die Leber, manchmal auch die Milz, die Aufgabe des Knochenmarkes mit übernimmt und hier die Blutbildung stattfindet. Aus diesen Konzepten und aus den neueren Daten der Stammzellforschung wurde klar, daß Stammzellen zwischen verschiedenen Organen hin- und herwandern können und möglicherweise auch in ganz andere Organe wie den Muskel, die Haut und das Nervengewebe differenzieren können.

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Was ist die Folge, wenn hämatopoetische Stammzellen nicht mehr funktionieren?

Genau dies ist das Problem bei Patienten mit Leukämien. Bestimmte Formen von Leukämie sind völlig harmlos und mit einer normalen Lebenserwartung verknüpft. Zu nennen ist hier eine Untergruppe der chronischen lymphatischen Leukämie, die dieses Wort eigentlich nicht verdient. Patienten, deren Blutzellen sich bei diesen Erkrankung nicht signifikant teilen und die auch noch andere Marker tragen, kann man beruhigen und ihnen mitteilen, daß diese Leukämie keine Bedrohung darstellt. Auf der anderen Seite stehen akute Leukämien, die ohne Behandlung innerhalb von 4 Wochen tödlich verlaufen können. Es gehört zur Aufgabe eines Hämatologen, die Erkrankung eines Patienten nicht nur korrekt innerhalb weniger Stunden zu diagnostizieren, sondern den Patienten dann auch entsprechend beraten zu können. Hämatologische Diagnostik, vor allen Dingen hämatologische Therapieverfahren sind äußerst komplex und erfordern einen großen Aufwand, insbesondere da seit wenigen Jahren die Stammzellen als Medikament gelten. Somit muß jede Klinik, die ein Stammzelllabor vorhält, wie ein Hersteller eines Medikaments betrachtet werden.

Rechts oben befindet sich der Eingangsbereich = D-Bereich. Der im Anschluß folgende Raum ist der Qualitätssicherungsbereich = C-Bereich. Von dort gelangt man durch eine weitere kleine Personalschleuse = PS in den eigentlichen Herstellungsbereich = B-Bereich; MS = Materialschleuse. In diesem befindet sich unter dem „Laminar flow“-Feld (LF) die „CliniMACS“-Säule, wo die Stammzellen ultrarein hergestellt werden.

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Was passiert nun in einem Stammzelllabor?

Dargestellt sind Stammzellen, welche nach Rhodamin-Falloidin Färbung im Fluoreszenzmikroskop mit Digitalkamera aufgenommen wurden. Anhand der sogenannten „Colony forming units“ (CFU) läßt sich das Wachstumspotential der Stammzellen in einer Zellkultur beurteilen. Nur bei ausreichendem Zellwachstum darf eine Stammzellprodukt für eine Transplantation eingesetzt werden.

Abbildung 2 zeigt den Grundriß unseres Stammzelllabors. Wir wollen dieses nicht in aller Ausführlichkeit schildern und bitten Sie, uns jederzeit bei Rückfragen anzusprechen. Grob gesagt ist das Stammzelllabor dafür da, ein reines und nach den Gesetzen hergestelltes Stammzellprodukt für den individuellen Patienten anzufertigen. Unser Stammzelllabor (Bereich hier mit B bezeichnet) hält einen absolut keimfreien, nach höchstem Standard vorgehaltenen Raum vor, der mit einer hohen Luftumwälzung die Keimfreiheit garantiert. In diesem Raum befinden sich 2 Sterileinheiten, in denen offen mit Blutprodukten gearbeitet werden kann, da hier nahezu Partikelfreiheit herrscht. Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter können diesen Bereich nur nach doppeltem Einschleusen und mit astronautenähnlichen Anzügen betreten. In diesem Labor sind alle Vorkehrungen vorgesehen, eine absolute Keimfreiheit zu gewährleisten. Materialien werden über eine Materialschleuse in das Labor hinein- und herausgebracht. Die Reinraumbedingungen im Raum B sehen vor:

1. Über 80fache Luftwechsel der gesamten Raumluft über Reinraumfilter
2. Ständige Überwachung des Druckgefälles vom reinen zum weniger reinen Raum (also von A nach D in der Abb. 2)
3. Vorgeschaltete Schleusen für Personal und Materialien
4. Tragen spezieller Reinraumbekleidung
5. Kontinuierliche Ãœberwachung der Reinraumbedingungen
6. Tägliche Reinigung des Labors
7. Verwendung reinraumtauglicher Materialien
8. Regelmäßige dokumentierte Schulung der Mitarbeiter

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Was genau geschieht nach der Sammlung der Stammzellen?

Vorbereitung einer Zellselektionierung zur Aufreinigung der Stammzellen. Die Selektionierung wird durchgeführt, um unerwünschte Abstoßungsreaktionen im Rahmen der allogenen Stammzelltransplantation zu vermeiden. Die Zellselektionierungsmaschine ist zur Vermeidung jeglicher Kontaminationen unter einer speziell eingerichteten Sterilwerkbank mit laminarem Luftstrom aufgestellt.

Die im Menschen durch die Apherese gewonnenen peripheren Blutstammzellen und das im Operationssaal gewonnene Knochenmark werden nach den geltenden Richtlinien auf Verwendbarkeit und Qualität getestet. Die absolute Zahl der Blutstammzellen wird in einem der Klinik angeschlossenen durchflußzytometrischen Labor bestimmt. Hier nutzen wir aus, daß sich periphere Blutstammzellen durch einen spezifischen Marker von anderen Zellen unterscheiden, das sogenannte CD34-Antigen. Für eine erfolgreiche Transplantation wird normalerweise eine Zahl von über 2,5 – 3x106 CD34 positiven Zellen/kg Körpergewicht des Empfängers angestrebt.

Es werden viele Proben zur Qualitätssicherung entnommen. Die Proben werden auch im Reagenzglas kultiviert, um zu untersuchen, ob neben der Zahl auch die Vitalität korrekt ist. Stammzelltransplantate, die vom Patienten für sich selbst (sogenannte autologe Blutstammzelltransplantation) stammen, werden nach der Präparation im Stammzelllabor tiefgefroren. Anschließend bekommt der Patient eine ultrahochdosierte Chemotherapie, die so toxisch für das Knochenmark ist, daß ohne Transplantation der dann aufgetauten Stammzellen ein Überleben unmöglich wäre. Muß z.B. bei Vorliegen bestimmter Leukämien das Transplantat von einem gesunden Spender entnommen werden (verwandter oder unverwandter Spender), gelten etwas andere Herstellungsrichtlinien. Hier wird man das Stammzelltransplantat im Allgemeinen nicht einfrieren müssen, da es entweder in unserer Klinik (verwandte Spendersituation) oder aber in einer anderen Institution gewonnen wird und dann am Tag der Gewinnung und Transplantation von einem unserer Mitarbeiter an diesem anderen Ort abgeholt wird. Wir haben Transplantate aus vielen verschiedenen Ländern bereits hier in Marburg eingesetzt. Voraussetzung für die Transplantation verwandter oder unverwandter Spenderzellen ist, daß die HLA-Merkmale von Spender und Empfänger identisch und zumindestens kompatibel sind. In einer der letzten Ausgaben des Klinikum Aktuell waren wir näher auf diese Problematik eingegangen. Oft ist es so, daß die Gewebsverträglichkeitsmerkmale nicht ganz 100%ig zueinander passen. Dann werden wir uns entschließen, die Zellen, die für eine Abstoßungsreaktion im Transplantat kodieren, die sogenannten T-Zellen, aus dem Transplantat zu entfernen, um nur die hämatopoetischen Stammzellen, nämlich Zellen mit dem CD34-Antigen, zu transplantieren. Der Nachteil bei dieser Maßnahme ist, daß die T-Zellen, die wir entfernt haben, unbedingt zum längerfristigen Anwachsen der Stammzellen benötigt werden. T-Zellen stellen nämlich nach heutiger Erkenntnis Wachstumsfaktoren her, die für das Anwachsen hämatopoetischer Stammzellen im Knochenmark von entscheidender Bedeutung sind. Daher werden wir in einer solchen Situation nach 4 – 8 Wochen bei Nichtvorliegen einer Abstoßungsreaktion ganz niedrige Dosen von T-Zellen des Spenders, die wir am selben Tag eingefroren haben, auftauen und dem Patienten zurückgeben. Hiermit verfolgen wir 2 Ziele:

1. Soll das Transplantat längerfristig im Körper anwachsen und
2. soll das Immunsystem des Patienten so gestärkt werden, daß es wirksam gegen die Leukämie kämpfen kann.

Die Transplantation gesunder Stammzellen, also von verwandten oder nicht verwandten Spendern, kann man auch mit einer Neugeburt vergleichen, da ein völlig neues Immunsystem in einen erwachsenen Körper hineintransplantiert wird und dieses Immunsystem nun wie ein kleiner Säugling alles neu erlernen muß. Diese Patienten müssen auch für die wichtigsten Infektionserkrankungen geimpft werden. Wenn die gefährliche Zeit der Transplantation (in den ersten 3 Monaten nach Transplantation versterben bis zu 30% der Patienten nach unverwandter Transplantation) vorbei ist, sind die Patienten dennoch nicht ohne Gefahr. Erstens droht immer das Leukämierezidiv und zweitens kann auch noch einem langen Zeitraum das Immunsystem so schwach sein, daß ein für einen Gesunden völlig harmloser Keim für diese Patienten zu einer großen Gefahr wird. Daher ist es wichtig, daß Patienten nach einer Stammzelltransplantation immer wieder von spezifisch hierin ausgebildeten Ärztinnen und Ärzten gesehen werden.

Ein Stammzelllabor muß Validierungs- und Qualitätssicherungsmaßnahmen unterzogen werden. Es wird hierfür die Kooperation mit ganz vielen Abteilungen des Klinikums, in Einzelfällen auch außerhalb unseres Klinikums notwendig. An dieser Stelle möchten wir unseren ausdrücklichen Dank an die Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter des Klinikums, insbesondere von den technischen Abteilungen, der Klimatechnik, aber auch aus dem Institut für Hygiene (stellvertretend sei hier Prof. Mutters genannt) bedanken.

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Beurteilung der Transplantatentwicklung nach Knochenmarktransplantation

Eine Knochenmarktransplantation hat also das Ziel, die blutbildenden Stammzellen eines Spenders auf einen an Leukämie erkrankten Patienten zu übertragen. Ist die Transplantation erfolgreich, so bilden die gesunden Blutvorläuferzellen im Patienten Nachkommen für alle Arten von Blutzellen. Die Stammzellen sind also die „Profis“ der Blutproduktion.

Wenn nach Bestrahlung, Chemotherapie und Übertragung des neuen Knochenmarks die ersten Blutzellen sich im Patienten wieder selbständig vermehren, so weiß man, daß das neue Knochenmark des Spenders angewachsen ist. Dies ist immer ein ganz großartiger Moment im „neuen Leben“ des Patienten nach der eingreifenden Maßnahme. Um ganz sicher zu sein, daß es sich bei den neuen Zellen um Spenderzellen, und nicht um zurückkehrende Leukämiezellen handelt, wird das Blut des transplantierten Patienten auf seine Identität als Spenderblut untersucht. Die Untersuchung der Blutgruppe ist hierfür nicht geeignet, weil sie sich erst im Laufe von Wochen und Monaten nach Transplantation ändern würde.

In unserer Klinik verwenden wir eine ganz neue molekulargenetische Methode zur Erkennung von Spender und Empfängerzellen, einen sogenannten genetischen Fingerabdruck. Im Falle einer geplanten Knochenmarktransplantation wird von Spender und Patient aus weißen Blutzellen Erbmaterial, die DNA, isoliert und jeweils das typische genetische Muster erfaßt. Nach der Transplantation nimmt das Blut des Patienten die genetischen Merkmale des Spenders an. Erst im Falle eines Transplantatversagens oder einer Rück-kehr der Krebserkrankung können wieder eigene Zellen im Blut des Patienten auftauchen. Man nennt den Zustand der Vermischung der genetischen Muster zweier Individuen in der Fachsprache „Chimärismus“, in Anlehnung an ein Fabelwesen der griechischen Mythologie, welches die Gliedmaßen verschiedener Tierarten trägt.

Unsere Arbeitsgruppe konnte vor kurzem zeigen, daß eine zusätzliche Chimärismusuntersuchung an sortierten Blutstammzellen möglicherweise für eine frühere Erkennung eines Rückfalls dem Patienten von Nutzen sein kann. Daher wird in unserer Arbeitsgruppe in einem von der Alfred und Ursula Kuhlemann geförderten Projekt untersucht, ob mittels magnetischer Techniken ein Anreicherung von Blutstammzellen derart zu vereinfachen ist, dass deren Chimärismusbestimmung in der Routine möglich wird.

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Schlussbemerkung

Die Transplantation hämatologischer Stammzellen gehört heute mit zu den größten Herausforderungen der modernen Medizin. Sie ist jedoch erst ein Beginn auf der langen Reise zu zellbasierten Therapien auch ganz anderer Erkrankungen als Leukämien oder Lymphome. Die großen Erfolge in der Transplantation hämatologischer Stammzellen lassen vermuten, daß auch bei anderen Organsystemen wirksame Therapien entwickelt werden können. Auf der anderen Seite sind die Nebenwirkungen und leider auch oft zu beklagenden Rückfälle der hämatologischen Erkrankungen Ansporn, die Therapieverfahren kontinuierlich weiter zu verbessern. Neben anderen Zielen hat sich diesem Ziel die Klinik für Innere Medizin mit Schwerpunkt Hämatologie/Onkologie und Immunologie am Klinikum der Philipps-Universität Marburg verschrieben. Sollten Rückfragen bestehen zu diesem Artikel, wenden Sie sich bitte jederzeit an uns. Sie finden uns im Klinikum Lahnberge oder unter: www.med.uni-marburg.de/haemonko

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